总蛋白提取试剂盒

货号：PK01  规格：50ml   使用范围：各种动物组织与细胞  

v 试剂盒组成、储存、稳定性：

试剂盒组成	保存	50-100T	运输
裂解液RIPA或者Mammalian Cell Lysis Reagent	4℃避光	50 ml	4℃蓝冰运输
100X PMSF(100mM) 蛋白酶抑制剂	-20℃	500ul	4℃蓝冰运输
100X磷酸酶抑制剂混合物	-20℃	500ul	4℃蓝冰运输

 

在上述保存条件下保质期1年

v 储存事项：

1. 如果环境温度低时裂解液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。

2. 

3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

v 产品介绍：

改进的裂解液RL一步法裂解细胞和灭活RNA 酶， 然后总RNA在高离盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤, 将细胞代谢物、蛋白等杂质去除， 最后低盐的RNase free water将纯净的RNA从硅基质膜上洗脱。

v 产品特点：

1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。

2. 纯度高和离心柱方便快捷，不需要异丙醇沉淀和乙醇洗涤过程，RNA可以直接从离心柱上洗脱避免了过度干燥不易溶解问题。

3. 独有的RL裂解液配方，可以有效的消除基因组污染，多次漂洗去蛋白过程，提取RNA纯度更高。

4. 有效的去除了5S在总RNA中含量，提高了纯度。

v 注意事项

1 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶中加入指定量乙醇，加入后请及时打  钩标记已加入乙醇，以免多次加入!

2 为防止RNA降解，所有离心步骤如未加说明，均在4℃低温进行。离心均以相对离心力g为单位，使用转速可以达到13，500 g 的台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。

3 裂解液RL和去蛋白液RE中含有刺激性有害化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

4 避免环境中RNA酶污染，操作要戴手套，所有吸头和 eppendorf 管以进口无菌无酶的最好。

5 血液抽取后应在4小时内提取RNA。冻存的血液RNA大部分丢失，不能用于提取。

6 本试剂盒含有实验室常用试剂氯仿，用户使用无需要自备氯仿。

7 尽量保证在膜中央加入洗脱液25μl-50μl，低于25μl将不能保证充分浸润吸附膜。

8 洗脱液pH<7.0时会降低RNA的洗脱效率，而国内实验室用水大多呈偏酸性，自备洗脱液时应当注意。本试剂盒提供的洗脱液为pH7.6。

9 加入裂解液RL匀浆后，加氯仿前，样品可在 –60℃-70℃ 保存一个月以上

The RIPA buffer is one of the most reliable buffers used to lyse cultured mammalian cells from both plated cells and cells pelleted from suspension cultures. This buffer enables protein extraction from cytoplasmic, membrane and nuclear proteins and is compatible with many applications, including reporter assays, protein assays, immunoassays and protein purification.  

Important Product Information  

• RIPA Buffer does not contain protease or phosphatase inhibitors. If desired, add protease inhibitors to the reagent to prevent proteolysis and maintain phosphorylation status of proteins. Add protease and phosphatase inhibitors immediately before use.  

• Use 1mL of cold RIPA Buffer for every 5 × 106 of HeLa or A431 cells (~20µL of packed cells, which is equivalent to ~40mg of cells). To obtain concentrated protein extracts, directly lyse cells on plate and use less buffer.   

• Some protein kinases and other enzymes may be sensitive to the components of the RIPA Buffer, resulting in their decreased activity. In such cases, prepare a RIPA buffer that does not contain sodium deoxycholate and SDS.  

• RIPA Buffer is compatible with the BCA Protein Assay Kit  

 Procedure for Lysis of Monolayer -cultured Mammalian Cells 

Note: If desired, add protease and phosphatase inhibitors to the RIPA Buffer immediately before use. 

1. Carefully remove (decant) culture medium from adherent cells. 

2. Wash cells twice with cold PBS. 

3. Add cold RIPA Buffer to the cells. Use 1mL of buffer per 75cm2flask containing 5 × 106 HeLa or A431 cells. Keep on ice for 5 minutes, swirling the plate occasionally for uniform spreading.  

4. Gather the lysate to one side using a cell scraper, collect the lysate and transfer to a microcentrifuge tube. Centrifuge samples at ~14,000 × g  for 15 minutes to pellet the cell debris.   Note: To increase yields, sonicate the pellet for 30 seconds with 50% pulse.  

5. Transfer supernatant to a new tube for further analysis.  

 

Procedure for Lysis of Suspension-cultured Mammalian Cells 

Note: If desired, add protease and phosphatase inhibitors to the RIPA Buffer immediately before use. 

1. Pellet the cells by centrifugation at 2500 × g for 5 m inutes. Discard the supernatant.  

2. Wash cells twice in cold PBS. Pellet cells by centrifugation at 2500 × g for 5 minutes.  

3. Add RIPA Buffer to the cell pellet. Use 1mL of RIPA buffer for 40mg (~5 × 106 of HeLa cells) of wet cell pellet. Pipette the mixture up   and down to suspend the pellet.   Note: To increase yields, sonicate the pellet for 30 seconds with 50% pulse.  

4. Shake mixture gently for 15 minutes on ice. Centrifuge mixture at ~14,000 × g for 15 minutes to pellet the cell debris.  

5. Transfer supernatant to a new tube for further analysis.  

Procedure for Tissue Lysis 

1. If desired, add protease inhibitors to the RIPA Buffer just before use.   

2. Weigh tissue samples. Use a ratio of ~1 g of tissue to 20mL RIPA Buffer. Use a smaller volume of RIPA Buffer if a more concentrated protein extract is required.  

3. Add the appropriate amount of RIPA Buffer to the tissue sample and homogenize.

4. Pipette the mixture to a new tube, Shake mixture gently for 15 minutes on ice.

5. Centrifuge the sample at 14,000 × g for 15 minutes to pellet cell/tissue debris.   

5. Collect supernatant and continue with downstream analysis or further purification.  

 

 

 

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