Membrane Protein Extraction Kit

Product Number: MC-01    Size: 50T 

Description 

The Membrane Protein Extraction Kit is designed for efficient isolation of membrane proteins from mammalian cells and tissue samples. The simple and rapid procedure isolates high quality membrane and cytoplasmic protein extracts without cross- contamination between the two fractions. Both fractions contain pure, non-denatured functional proteins which can be used directly in a variety of proteomics applications. 

The kit is supplied with sufficient reagents for 50 extractions from 5 million cells or 20-40 mg of tissue per experiment.

 

Kit Contents: 

Cell Permeabilization Buffer ,  CPB  100 ml 

Membrane Protein Extraction Buffer  MPEB  50ml

Cell Wash Solution  CWS 100ml  2 bottles

 

Storage: Upon receipt store kit components at 4°C. Product is shipped at ambient temperature. This product is guaranteed for one year from the date of purchase when handled and stored properly. 

 

Introduction :

The procedure is based on stepwise differential protein solubilization. Treatment with different mild, non-denaturing detergent based buffers selectively separates membrane and membrane-associated proteins from the cytoplasmic fraction.

Cells are first permeabilized with the Cell Permeabilization Buff er to release the cytoplasmic protein fraction. The cell debris is then treated with the Membrane Protein Extraction Buffer which selectively solubilizes the majority of integral and membrane-associated proteins and

isolates them as a separate fraction

 

Important Procedural Notes 

The extraction should be performed on ice. Ice-cooled buffers should be used.

The provided protocols apply to membrane protein extraction fr om up to 5 million cells and 20-40 mg of tissue sample. For  larger amounts of cells or ti ssue, scale up the volume of buffers proportionally.

A protease inhibitor cocktail (e.g., Protease Inhibitor Cocktail #PIC01.) may be added to Cell Permeabilization Buffer and Membrane Protein Extraction Buffers to minimize proteolysis.

 

Procedure   

A :Suspension cells

1.Pellet up to 5x106 cells by centrifugation for 5 minutes at 500 x g. Discard the supernatant;

2.Resuspend cells in 3 ml of ice-cold Cell Wash Solution and repeat centrifugation. Discard the supernatant.

3.Resuspend cells in 1ml of ice-cold Cell Wash Solution and transfer into a 1.5 ml eppendorf tube .Centrifuge cells for 5 minutes at 

500 x g, Discard thesupernatant.

4.Add 1 ml of ice-cold Cell Permeabilization Buffer(CPB) and vortex briefly to eliminate cell clumps. Incubate for 10 minutes at 4°C while continuously rocking.

5.Centrifuge the permeabilized cells at 16000 x g for 5 minutes at 4°C. 

6.Carefully remove the supernatant ( cytoplasmic proteinextract ) and transfer it into a new tube. Use directly or store aliquots at -70°C for later analysis.

7.Set the cell pellet on ice. 

Note . The cell debris pellet contains membrane proteins.Make sure to remove all liquid, which contains cytoplasmic proteins. 

8.Add 1 ml of ice-cold Membrane Protein Extraction Buffer(MPEB) to the cell debris pellet. Pipet thoroughly to mix. 

9.Incubate mixture for 30 minutes at 4°C in thethermomixer, shaking at 1400 rpm.

10.Clear membrane protein extract by centrifugation at 16000 x g for 15 minutes at 4°C.

11.Transfer the supernatant (membrane protein fraction) into a new tube. Use directly or store aliquots at -70°C for later analysis.  

 

B. Adherent cells 

Plate cells in a 6 cm tissue culture plate. The cells should be 60-90% confluent on the day of analysis. Permeabilization of overgrown cells is less efficient and the membrane proteinfraction may become contaminated with cytoplasmic proteins. 

The recommended amount of buffers should be adjusted depending on the cell line and the intended downstream application of extracted protein.

 

1.Remove the growth medium from the cells. Rinse the cells once with 3 ml of ice-cold Cell Wash Solution (CWS) 

 Note . Pipette the buffer down the inside wall of the tissue culture plate to avoid disruption of the cells.

2.Add 1 ml of ice-cold Cell Permeabilization Buffer (CPB) (slowly and gently) into the plate (do not add directly to the cells). Incubate for 10 minutes at 4°C, rocking gently.

3.Collect the cytoplasmic fraction from the permeabilized cell monolayer and transfer it into the microfuge tube. Use directly or store aliquots at -70°C for later analysis.

Note . If cell debris is observed in the collected sample,centrifuge the tubes at 16000 x g for 15 minutes at 4°C and transfer the supernatant into a new microfuge tube.

4.Make sure to remove all liquid from the permeabilized cell monolayer, which contains cytoplasmic proteins. 

Note . If the cells have detached during this procedure scrape the cells off and collect everything into the microfuge tube.Continue as with suspension cells from the step Extraction of cytoplasmic proteins  (No 5)

5.Add 1 ml of ice-cold Membrane Protein Extraction Buffer(MPEB) on to the monolayer of permeabilized cells and incubate mixture for 30  minutes at 4°C shaking constantly at 450 rpm. 

6.Collect the membrane protein extract into a microfuge tube.

7.Clear membrane protein extract by centrifugation at 16000 x g for 15 minutes at 4°C. 

8.Transfer the supernatant (membrane protein fraction)into a new tube. Use directly or store aliquots at -70°C for later analysis.

9.

 Isolate 50 µl packed cell volume (~100 mg) of cells in a 1.5 ml microcentrifuge tube by centrifugation at 500 x g for 2-3minutes. 

    Note: Use one of the following methods to process a tissue sample: 

• Cut the tissue into small pieces, add an appropriate buffer such as PBS, and homogenize in a tissue homogenizer. Pellet the cells by centrifugation at 500 x g for 2-3 minutes and remove the supernatant. Estimate the packed cell volume, add the appropriate amount of Reagent A according the chart on page 1, and continue with Step 4 below. 

• Weigh the tissue, cut it into small pieces, dounce homogenize directly in Reagent A, and proceed to Step 4. Use a 10-fold excess of Reagent A over the weight of tissue (e.g. 500 µl Reagent A to 50 mg tissue). In Step 5 of the protocol, use 75 µl of Reagent B per 100 µl of Reagent A. 

2. Using a pipet, carefully remove and discard the supernatant, leaving cell pellet as dry as possible. 

3. Add 500 µl of ice-cold Reagent A to the cell pellet. 

4. Vortex the tube vigorously on the highest setting for 15 seconds to fully resuspend the cell pellet. Incubate the tube on ice for 10 minutes.   

5. Centrifuge at 4˚C at 16,000 x g for 5 min. 

6. Remove supernatant and keep it (this will contain everything except large plasma membrane pieces,DNA, nucleoli), extract out 10 µl for Bradford assay. 

7. On ice resuspend pellet in 374 µl of Reagent B and add 26 µl of Reagent C (high salt helps lyse membranes and forces DNA into solution). 

8 .Vortex on the highest setting for 15 seconds. Return the sample to ice and continue vortexing for 15 seconds every 10 minutes, for a total of 30 minutes. 

9. Centrifuge the tube at maximum speed (~16,000 x g) in a microcentrifuge for 10 minutes. 

10. Immediately transfer the supernatant (nuclear extract) fraction to a clean pre-chilled tube. Place on ice. 

11. Store all extracts at -80°C until use. 

Troubleshooting   

  

Origin:  Pioneer Biotechnology,Inc of China

Distributor: Pioneer Biotechnolgy,Inc 

Contact:  Tel 029-88237772 or 13484545009  Fax 029-88237772

  E-mail : xfyangbio@163.com

          Internet: www.xfbio.com